技术文章
鹿木生科
免疫组化（IHC）实验全流程指南
核心要点
- 流程环环相扣：脱蜡 → 抗原修复 → 封闭 → 抗体孵育 → 显色 → 复染 → 封片 → 成像
- 关键变量：抗原修复方式、抗体浓度与孵育条件、显色时间
- ICC 多出固定与通透环节，洗涤需更轻柔
- 可复现为先：固定流程与参数，方能稳定产出可比较的切片
一、样本准备与固定
固定参数
- 10% 中性缓冲福尔马林（NBF）
- 组织厚度 3–5 mm
- 固定液体积 ≥ 组织体积 ×10
- 室温 6–24 h（小鼠 6–12 h，人标本 12–24 h）
切片参数
- 梯度乙醇脱水 → 二甲苯透明 → 石蜡包埋
- 切片 3–5 μm（推荐 4 μm）
- APES / 多聚赖氨酸防脱片载玻片
- 烤片 60 °C 1–2 h 或 37 °C 过夜
注意：固定不足 → 中心区抗原丢失、形态差；固定过度 → 醛交联遮蔽表位，染色弱或假阴性。
二、脱蜡与水化
| 步骤 | 试剂 | 时间 |
|---|---|---|
| 二甲苯脱蜡 | 二甲苯 I、II | 各 10 min |
| 无水乙醇 | ×2 | 各 5 min |
| 梯度水化 | 95% → 80% → 70% 乙醇 | 各 3–5 min |
| 冲洗 | 蒸馏水 → PBS/TBS | 洗 3 次，每次 3–5 min |
关键：脱蜡不彻底是片状无信号的常见原因，残留石蜡阻碍修复液与抗体渗透。
三、抗原修复（信噪比核心步骤）
热诱导修复（HIER）
- 柠檬酸缓冲液 pH 6.0 → 胞质 / 胞膜抗原
- EDTA pH 8–9 或 Tris-EDTA pH 9.0 → 核抗原 / 磷酸化抗体
- 微波中高火至沸 → 低火 15–20 min
- 水浴 / 金属浴 95–100 °C 20–40 min
- 高压锅 121 °C 2–3 min
- 室温自然冷却 20–30 min，严禁骤冷
酶消化修复
- 胰蛋白酶 / 胃蛋白酶 / 蛋白酶 K
- 37 °C 10–30 min
- 适用于 HIER 效果不佳的抗原
- 易损伤形态，须严格控时并预实验
注意：修复液须完全浸没切片，避免干片与暴沸脱片。不同抗体最优修复条件不同，应查说明书或预实验确定，不宜直接照搬。
四、阻断内源酶与封闭
阻断内源性酶
| 显色系统 | 阻断剂 | 条件 |
|---|---|---|
| HRP | 3% H₂O₂（甲醇或 PBS） | 室温 10–15 min |
| AP | 左旋咪唑 | 室温 10–15 min |
封闭非特异性结合
- 5–10% 正常血清（与二抗同种属）或 5% BSA
- 室温 30–60 min
- 甩去封闭液后直接加一抗，不要洗涤
五、一抗与二抗孵育
| 环节 | 条件 | 要点 |
|---|---|---|
| 一抗 | 稀释 1:100–1:1000；4 °C 湿盒过夜 或 室温 1–2 h | 切片全程保持湿润，干片致强背景与假阳性；孵育后 PBS/TBS 洗 3 × 3–5 min |
| 二抗 | 聚合物二抗室温 30–60 min；生物素化二抗需加 SA-HRP / ABC 30 min | 种属与显色系统须匹配；生物素系统可用 TSA 放大但需阻断内源性生物素 |
六、显色
DAB（棕褐色）
- 醇溶性，可苏木素复染并常规脱水封片
- 现配现用：0.05% DAB + 0.01–0.03% H₂O₂
- 室温 1–10 min，镜下控时
- 阳性清晰而背景尚浅时立即终止
- 致癌，戴手套，废液按危废处理
AEC（红色）
- 水溶性，须用甘油明胶等水性封片剂
- 不能经乙醇与二甲苯
显色时间是信噪比最敏感的变量，同一批实验必须统一。
七、复染、脱水与封片
| 步骤 | 操作 | 要点 |
|---|---|---|
| 复染 | 苏木素 1–5 min → 流水冲洗 → 必要时盐酸乙醇分化 → 返蓝 | 复染过深掩盖弱阳性信号，弱表达靶点缩短时间 |
| 脱水 | 70% → 80% → 95% → 无水乙醇（×2）各 2–5 min → 二甲苯透明 ×2 各 5 min | — |
| 封片 | 中性树胶封片，加盖盖玻片 | 避免气泡与封片剂溢出；平放过夜干燥后避光保存 |
八、成像与判读
- 低倍镜（4× / 10×）确认组织与阳性区域，再用 20× / 40× 采图
- 同实验统一白平衡、曝光时间与增益，否则强度不可比
- 记录：阳性定位（核 / 质 / 膜）、强度分级（0, 1+, 2+, 3+）、阳性细胞百分比
- 半定量可用 H-score：Σ（强度等级 × 对应阳性比例），范围 0–300
ICC 的差异步骤
- 细胞爬片 / 腔室玻片培养至 50–70% 汇合度，避免过密
- PBS 轻洗 → 4% 多聚甲醛室温固定 10–15 min，或冷甲醇 / 丙酮 −20 °C 10 min
- PBS 洗 3 次 → 0.1–0.5% Triton X-100 或 0.1% 皂苷通透 5–10 min（胞膜抗原可省略）
- 后续封闭、抗体孵育、显色同 IHC，但洗涤更轻柔，防细胞脱落
对照设置
| 对照类型 | 做法 |
|---|---|
| 阴性对照 | 同种属、同浓度非免疫 IgG，或省略一抗 |
| 阳性对照 | 已知表达该靶点的组织或细胞 |
| 内参对照 | 同片内可明确识别的结构（如上皮旁间质） |
无信号时，先确认阳性对照与内参是否成立，再判断是靶点不表达还是实验失败。
常见问题排查
| 问题 | 可能原因 |
|---|---|
| 背景过高 | 一抗浓度过高 / 孵育过久、封闭不足、内源酶或生物素未阻断、DAB 显色过久、切片干涸 |
| 无信号 / 弱 | 脱蜡不彻底、抗原修复不足或方式不符、固定过度、抗体失活 / 浓度过低、显色液失效 |
| 组织脱片 | 烤片不足、修复温度过高或冷却过快、切片过厚 |
| 染色不均 | 修复液未浸没、受热不均、抗体覆盖不均 |
| 非特异颗粒 | 二抗聚集、DAB 沉淀、血清未离心 |
流程速查表
| 环节 | 时间参考 | 控制要点 |
|---|---|---|
| 烤片 | 60 °C 1–2 h | 防脱片，组织贴附牢固 |
| 脱蜡水化 | 二甲苯 20 min + 梯度乙醇 | 脱蜡必须彻底 |
| 抗原修复 | 95–100 °C 20–40 min | 修复液与方式经预实验确定，自然冷却 |
| 阻断 | 室温 10–15 min | HRP 用 H₂O₂，AP 用左旋咪唑 |
| 封闭 | 室温 30–60 min | 血清种属匹配，甩干不洗 |
| 一抗 | 4 °C 过夜 | 浓度需梯度预实验，保持湿润 |
| 二抗 | 室温 30–60 min | 种属与显色系统匹配 |
| 显色 | 1–10 min | 镜下控时，批间统一 |
| 复染 | 1–5 min | 弱信号缩短复染 |
| 脱水封片 | 梯度乙醇 + 二甲苯 | 避免气泡与封片剂溢出 |
| 成像 | 按需采图 | 统一白平衡与曝光参数 |
关键控制点清单
- 固定时间与组织厚度统一，固定液足量
- 烤片 60 °C 1–2 h，使用防脱片玻片
- 二甲苯脱蜡彻底，无水化残留
- 抗原修复条件经预实验确定，自然冷却
- 正确阻断内源酶：HRP → H₂O₂，AP → 左旋咪唑
- 一抗做浓度梯度预实验，4 °C 过夜孵育
- 显色全程镜下控时，同批次统一
- 对照齐全，参数固定，记录完整，便于重复与比较
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